Stanovení diagnózy myastenie spočívá v pečlivém rozboru  obtíží pacienta. Důležitý je údaj o slabosti a unavitelnosti více  postižených svalových skupin, které výrazně kolísá. Komplikovaněší bývá stanovení diagnózy v případech, kdy je postižena jen jedna svalová skupina, nejčastěji svaly okohybné (okulární myastenie).

Následuje klinické vyšetření, které je založeno na provokaci oslabení jednotlivých svalových skupin zátěžovými testy. Na základě klinického vyšetření by již mělo být vysloveno podezření na chorobu, či naopak vyjádřeny pochybnosti o diagnóze myastenie. Je nutné zvážit, zda se nejedná o jiné neurologické onemocnění.

K potvrzení, či vyloučení myastenie slouží následující testy:

- Eletromyografické vyšetření je založeno na snímání akčního potenciálu ze svalu po jeho předchozí stimulaci elektrodou přiloženou na nerv, který dotyčný sval inervuje. Provádí se tzv. repetitivní stimulace, tedy opakovaná aplikace stimulu. Pokles akčního potenciálu mezi 1. a 4.-5. impulzem o více než 10% svědčí o poruše nervosvalového přenosu. Citlivějším je vyštření SF EMG (metoda měření jednoho svalového vlákna) velmi malou elekrodou. Prodloužení nebo blokování akčního potenciálu svědčí pro poruchu, která ale může být přítomna i u jiných nervosvalových chorob.

- Farmakologické testy se provádějí vyjímečně, ale mohou pomoci hlavně u oční formy onemocnění. Podá se krátkodobě působící inhibitor cholinesterázy (Syntostigmin, v zahraniční Tensilon, který u nás není dostupný) a sleduje se, zda dojde ke zlepšení oslabení očních svalů. (video). Někdy provádíme chladový test, kdy může dojít po přiložení ledu na spadlé víčko k jeho zvednutí.

- Vyšetření protilátek proti acetylcholinovému receptoru (AChR) je pozitivní u cca 80% pacientů. Provádí se klasickým odběrem krve. V případě normálního nálezu, kdy je diagnóza pravděpodobná doplňujeme ještě vyšetření protilátek proti receptoru svalově specifické kinázy (MuSK), což je bílkovina, která se nachází tak jako AChR na postsynaptické membráně a je nutná pro zabudování AChR do membrány. Tyto protilátky jsou pozitivní asi ve 40% AChR negativních pacientů. U pacientů s thymomem a u některých starších pacientů jsou pozitivní protilátky proti příčně pruhovaným svalům, tzv. antistriatální protilátky (ASMaB), nebo protilátky proti velké svalové bílkovíně - titinu, který je možné v současné době vyšetřit. V posledních letech se prokázalo, že existují i jiné protilátky, které se podílejí na vzniku a rozvoji myastenie, např. LPR4 (nízkodenzitní lipoproteinový receptor 4), který za přítomnosti MuSK umožňuje shlukování AChR a tím jeho správnou funkci.

- Vyšetření computerovou tomografií (CT) mezihrudí (mediastina) s aplikací kontrastní látky můžeme objevit nádor mediastina - thymom, který se u myastenie vyskytuje asi v  10 - 15%. V naprosté většině jde o nádor nezhoubný, někdy ale může prorůstat vazivové pozdro a proto se po operaci provádí místní ozáření. Bohužel, i když se operačně nádor odstraní, myastenie se tím nevyléčí a pacienti musí brát trvale léky, potlačující patologické imunitní reakce. V některých případech může být nalezen thymom, bez myastenických příznaků, nejčastěji náhodně a myastenie se může objevit i řadu let po jeho odstranění.